4.5. Обнаружение и идентификация отравляющих веществ по продуктам их трансформации

И.А. Родин

Обнаружение продуктов трансформации отравляющих веществ (ОВ) в биологических объектах и объектах окружающей среды позволяет устанавливать факты применения ОВ, наблюдать за утечкой ОВ при их хранении, а также решать много других важных проблем. Разработка соответствующих методов осложнена необходимостью обнаружения очень малых количеств аналитов (10^-9 г/мл и ниже) и сложным общим составом анализируемых объектов. Подобные аналитические задачи возникают и в смежных областях, например в медицине, фармакологии и токсикологии, при антидопинговом контроле. Требования к чувствительности, селективности и информативности анализа устанавливаются исходя из физиологической активности изучаемого соединения и типа объекта анализа. Для обнаружения продуктов трансформации необходима разработка способов высокочувствительного определения этих соединений.

В этом случае перспективно использование гибридного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС, ВЭЖХ-МС/МС). Метод характеризуется высокой селективностью и чувствительностью, а также позволяет получать большой объем данных в ходе одного анализа. По сравнению с газовой хромато-масс-спектрометрией (ГХ-МС) при использовании ВЭЖХ-МС отсутствуют ограничения по летучести и термической стабильности определяемых соединений, существенно расширяется диапазон исследуемых соединений. Благодаря широкому набору сорбентов для ВЭЖХ-МС и большой вариабельности в выборе состава подвижных фаз достигается уникальная возможность управления селективностью разделения соединений различных классов. Использование различных вариантов ионизации, а также широкие возможности проведения масс-спектрометрического детектирования позволяют достигать низких пределов обнаружения, обеспечивать высокую селективность (в ряде случаев специфичность) детектирования, что позволяет решать наиболее сложные задачи.

Значительными ограничениями при использовании ВЭЖХ-МС для определения физиологически активных веществ, в том числе продуктов трансформации ОВ, является малое число уже разработанных методик (метод недавно используют для решения таких задач, в отличие от ГХ-МС), отсутствие общих подходов к разработке таких методик, а также проблема привязки разработанных методик к конкретным приборам. Так, сложный механизм ионизации, протекающей при атмосферном давлении, делает получаемую масс-спектральную информацию сильно зависимой от конструкции прибора.

Представлялось важным отыскание новых подходов к разработке методик определения указанных соединений, основанных (подходов) на закономерностях удерживания и ионизации в ВЭЖХ-МС, обусловленных физико-химическими свойствами этих аналитов. Такие подходы должны включать получение сведений об общих масс-спектрометрических характеристиках аналитов, например об особенностях формирования масс-спектров, мало зависящих от конструкции источника ионизации и особенностей поведения ионов соединений в условиях тандемного масс-спектрометрического эксперимента, а также общие характеристики хроматографического поведения при разделении в условиях ВЭЖХ.

В Приложениях к Конвенции о запрещении разработки, производства, хранения и использования химического оружия (КЗХО) содержится список токсичных веществ, включающий тысячи химических соединений. Большую часть из них составляют органические вещества с различными физико-химическими свойствами: кислоты, основания, соединения с группами, содержащими гетероатомы фосфора, серы, мышьяка, фтора и/или хлора. В качестве аналитов мы выбрали соединения нескольких классов, являющиеся основными продуктами трансформации нервно-паралитических ОВ (диалкилтаурины и О-алкилметилфосфоновые кислоты, алкилфосфоновые кислоты), иприта (продукты разложения под действием фермента β-лиазы, тиодигликолевая кислота) и люизита (2-хлорвиниларсоновая и 2-хлорвиниларсонистая кислоты), обладающих свойствами полярных соединений и относящихся к нелетучим веществам. Указанные вещества являются специфичными маркерами основных классов отравляющих веществ, т.е. не встречаются в окружающей среде и способны сохраняться в объектах анализа в течение длительного времени; по своему происхождению они являются продуктами превращений именно отравляющих веществ.

Для определения этих аналитов ранее использовали преимущественно методы ГХ-МС и ГХ-МС/МС, существенным ограничением которых является невозможность прямого определения сильно полярных продуктов превращения ОВ. Особые трудности возникают при использовании данных методов в анализе сложных биологических и природных образцов. Методы ВЭЖХ-МС и ВЭЖХ-МС/МС позволяют решать указанную проблему.

Целью нашей работы было развитие методических основ высокочувствительного определения органических соединений высокой полярности, являющихся продуктами трансформации ОВ, в биологических материалах и в объектах окружающей среды с использованием в основном метода жидкостной хромато-масс-спектрометрии с различными способами ионизации в вариантах одномерной и тандемной масс-спектрометрии. Существенное внимание было уделено разработке способов определения О-алкилметилфосфонатов – продуктов гидролиза зарина, зомана, VX и RVX в объектах окружающей среды и биологических объектах, а также диалкилтауринов – продуктов окислительной трансформации V-газов – нервно-паралитических ОВ методом ВЭЖХ-МС, а также методом капиллярного зонного электрофореза с ультрафиолетовым детектором.

Определение диалкилтауринов методом капиллярного электрофореза. Диметилтаурин (ДМТ), 2-(диэтиламино)-этансульфоновая кислота (диэтилтаурин, ДЭТ), 2-(дипропиламино)-этансульфоновая кислота (дипропилтаурин, ДПТ) и 2-(диизопропиламино)-этансульфоновая кислота (диизопропилтаурин, ДИТ) – это продукты окислительной трансформации ОВ класса V-газов (рис. 1). Диалкилтаурины проявляют свойства органических оснований средней силы, легко протонируются в слабокислой среде, образуя положительно заряженные ионы, а также могут образовывать отрицательно заряженные ионы за счет депротонирования сульфогрупп.

Рис. 1. Структурные формулы О-алкилметилфосфонатов и диалкилтауринов. МФК – метилфосфоновая кислота, ЭМФК – этил-метилфосфоновая кислота, иПрМФК – изопропил метилфосфоновая кислота, ПинМФК- пинаколил метилфосфоновая кислота, иБутМФК – изобутилметилфосфоновая кислота, ДМТ – 2-(N, N –диметиламино)-этансульфоновая кислота, ДЭТ - 2-(N, N –диэтиламино)-этансульфоновая кислота, ДПТ - 2-(N, N –дипропиламино)-этансульфоновая кислота, ДИТ – 2-(N, N –диизопропиламино)-этансульфоновая кислота.

Разрабатывали простую скрининоговую методику определения диалкилтауринов методов капиллярного электрофореза с прямым спектрофотометрическим детектированием. Оптимальные результаты достигаются при использовании для детектирования длины волны 200 нм, что совпадает с литературными данными при определении таурина. Использовали гидродинамический ввод пробы. Показано, что при отсутствии сильного влияния компонентов матрицы увеличение объёма вводимой пробы может быть использовано для дополнительного повышения чувствительности определения (вплоть до 500 мбар×с с сопутствующим уменьшением эффективности разделения в 2–3 раза). Уменьшение напряжения практически не влияет на селективность разделения, «растягивая» электрофореграмму по оси времени. Стоит отметить также возрастающее искажение пика ДИТ при уменьшении напряжения. Показано, что концентрация боратного буфера (pH 8,85) практически не влияет на разрешение пиков, однако с увеличением концентрации, по сравнению с исходной 20 мM, изменятся порядок выхода мешающего системного пика и пика ДИТ; при концентрации 30 мМ они накладываются друг на друга, а при концентрации 40 мМ выходят в обратном порядке. Кроме того, при увеличении концентрации ведущего электролита сильно возрастает значение электрического тока, текущего через капилляр.

В выбранных условиях получены электрофореграммы и построены градуировочные зависимости для стандартных смесей, содержащих четыре исследуемых диалкилтаурина, в диапазоне концентраций 5–250 мкг/мл. Расчитаны пределы обнаружения и метрологические характеристики разработанного подхода [1, 2].

Группа масс-спектрометрии лаборатории хроматографии

Определение диалкилтауринов методом ВЭЖХ-МС. Для выбора характеристичных ионов в режиме регистрации выделенных ионов для детектирования диалкилтауринов изучали масс-спектры, получаемые в условиях химической ионизации при атмосферном давлении (ХИАД) и выбирали пики ионов, имеющие наибольшую интенсивность. В спектрах всех диалкилтауринов наиболее интенсивны сигналы протонированных молекул, для ДМТ и ДЭТ фрагментация незначительна (на спектре присутствуют молекулярные ионы с m/z 154 и 182), а в случае ДПТ и ДИТ в масс-спектрах присутствуют ионы-продукты, образующиеся при отщеплении сульфогруппы (m/z 128). Масс-спектры ДПТ и ДИТ, являющихся изомерами, очень похожи. Выбранные характеристичные ионы: ДМТ – 154; ДЭТ – 182; ДПТ – 210; ДИТ – 210 m/z.

Для всех исследуемых соединений максимальное соотношение сигнал/шум достигается при использовании кислых подвижных фаз, а величина аналитического сигнала достигает наибольшего значения при рН 5,4 и мало меняется при дальнейшем снижении рН, что, по-видимому, связано с ростом и достижением постоянной величины мольной доли протонированных ионов в кислой среде. Были изучены условия хроматографического разделения диалкилтауринов. Благодаря наличию гидрофобных алкильных радикалов в структуре диалкилтаурины удерживаются в условиях обращённо-фазовой ВЭЖХ, при этом достигается высокая селективность разделения. При использовании подвижной фазы с рН 5,4 достигаются необходимые значения хроматографических параметров (коэффициенты ёмкости находятся в диапазоне 2–7), удерживание реализуется преимущественно за счёт гидрофобных взаимодействий, наблюдается хорошая селективность разделения. Таким образом, использование аммонийно-ацетатного буферного раствора с рН 5,4, хорошо совместимого с масс-спектрометром, позволяет успешно реализовывать хроматографическое разделение диалкилтауринов. Выбранные условия градиентного элюирования обеспечивают разделение смеси с необходимой эффективностью и разрешением за приемлемое время.

В выбранных условиях получены градуировочные зависимости для изучаемых диалкилатауринов в диапазоне концентраций 0,05–10 мкг/мл, оценены пределы обнаружения и другие метрологические характеристики. Предложенный подход характеризуется приемлемой чувствительностью, высокими метрологическими характеристиками [2].

Для проверки разработанных способов были приготовлены модельные пробы с различным содержанием целевых веществ в водах разного химического состава. Результаты проверки подтвердили возможность практически применять разработанный хромато-масс-спектрометрический способ определения диалкилтауринов. Можно надежно обнаруживать данные вещества в сточных водах.

Определение алкилметилфосфоновых кислот. Чтобы исключить ошибки при проведении анализов, Организация по запрещению химического оружия (ОЗХО) регулярно ужесточает требования, предъявляемые к способам обнаружения маркеров ОВ. В связи с этим мы разработали высокочувствительный селективный способ определения иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК (см. рис. 1) с использованием метода ультра-ВЭЖХ-МС-МС. Применяли сорбенты с диаметром зерна 2–3 мкм и повышенное давление в системе. Это обеспечивает экспрессность анализа и высокую эффективность разделения, а с использованием варианта тандемного масс-спектрометрического детектирования появляется возможность определять следовые количества веществ. Известно, что наиболее высокая чувствительность масс-спектрометрического детектирования органических кислот достигается при работе в режиме регистрации отрицательных ионов. О-алкилметилфосфонаты – маркеры фосфорсодержащих ОВ (зарина, зомана и RVX) – относятся к группе органических кислот средней силы, поэтому условия детектирования изучали в данной полярности ионов. Для масс-спектров исследуемых соединений характерны интенсивные пики депротонированных молекул, соответствующие потере подвижного протона фосфоновой группы. Кроме того, в масс-спектре соединений присутствуют малоинтенсивные пики, соответствующие фрагментному иону, возникающему при разрыве связи Alk-O и представляющего собой анион метилфосфоновой кислоты. Для достижения максимального соотношения сигнал-шум при определении иБутМФК, иПрМФк и ПинМФК в качестве характеристичных ионов выбраны: для иПрМФК – 9 5, 137; для иБутМФК – 95, 151; для ПинМФК – 95, 179.

Было показано, что депротонированные молекулы иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК распадаются с образованием иона метилфосфоновой кислоты с m/z 95 и иона-продукта с m/z 79.

В качестве неподвижной фазы при разделении иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК использовали колонку с обращенно-фазовым сорбентом Acclaim RSLC. Для снижения размывания хроматографических пиков и подавления диссоциации в качестве подвижных фаз использовали 0,5%-й водный раствор муравьиной кислоты и 0,5%-й раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле. Для определения использовали программу градиентного элюирования, в условиях которой коэффициенты ёмкости иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК составили 3,9; 5,6; 2,0 и 4,7 соответственно, что приемлемо для хроматографического анализа.

Для определения О-алкилметилфосфонатов методом ВЭЖХ-МС в крови необходима пробоподготовка. В настоящее время наиболее эффективным способом пробоподготовки при анализе сложных объектов биологического происхождения считается твердофазная экстракция (ТФЭ). Способ характеризуется высокой селективностью и высокими степенями извлечения. Для достижения необходимой чувствительности определения необходимо разработать процедуру ТФЭ, которая характеризуется эффективным удалением мешающих компонентов пробы и высокими степенями извлечения определяемых соединений. Для разработки процедуры ТФЭ использовали плазму крови человека, полученной от добровольцев разного пола и возраста. В каждый образец плазмы вносили добавку смеси иПрМФК, иБутМФК и ПинМФК в количествах, необходимых для создания концентраций изучаемых веществ на уровне 200 нг/мл плазмы. Сравнили значения степеней извлечения определяемых соединений, достигаемые при использовании различных схем пробоподготовки. Наилучшие результаты были достигнуты при использовании картриджа Strata SDB-L, для которого величина пропускания наших аналитов составила более 85%. Для картриджа Strata Screen C пропускание иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК не превышает 80% и характеризуются худшими величинами воспроизводимости.

С использованием предложенных схем масс-спектрометрического детектирования, хроматографического разделения и пробоподготовки определены значения пределов обнаружения иПрМФК, иБутМФК и ПинМФК в плазме крови человека, которые составили 4 нг, 1 нг и 0.6 нг в 1 мл, соответственно.

Для практической проверки разработанного способа определения О-алкилметилфосфонатов кислоты методом ВЭЖХ-МС изучали образцы плазмы крови крыс, получавших внутривенно различные ФОВ в количестве соответствующем половине дозы, вызывающей гибель половины животных (LD₅₀). Образцы отбирали у выживших крыс через различные промежутки времени после интоксикации. Проверку проводили на пробах in vivo, проанализированных методом ВЭЖХ-МС. Было показано, что присутствие маркера ФОВ может быть достоверно обнаружено. Определение маркеров удалось провести во всех пробах, кроме пробы 48 часовой плазмы крысы, получавшей RVX. По полученным данным построены кривые выведения продуктов трансформации ФОВ для крыс. Апроксимация полученных данных степенной функцией характеризуется высокими значениями коэффициентов корреляции.

Таким образом, предложенный подход характеризуется высокой чувствительностью и позволяет проводить определение О-алкилметилфосфонатов как маркеров ФОВ в плазме вплоть до двух суток после отравления несмертельными (½ LD₅₀) дозами нервно-паралитических отравляющих веществ – зарином, зоманом и российским VX (RVX). Данный способ может быть использован для установления типа ОВ, воздействию которого подвергся пострадавший [3–5].

Рис. 2. Структурная формула четырёх маркеров применения нервно-паралитических отравляющих веществ.

Определение продуктов трансформации V-газов. C использованием метода ВЭЖХ-МС/МС разработан подход к определению четырех маркеров применения нервнопаралитических ОВ S-(2-диэтиламиноэтил)-метилфосфонотиоата (ДЭМФ), S-(2-диизопропиламиноэтил) метилфосфонотиоата (ДПМФ), бис(2-N,N-диэтиламиноэтил)дисульфида (ДЭАС) и бис(2-N,N-диизопропиламиноэтил)дисульфида (ДПАС) (рис. 2) в водных объектах. Эти вещества образуются в водных средах при трансформации веществ класса V-газов (в частности – производные с изопропильными и этильными заместителями при атоме азота являются продуктами разложения VX и VR соответственно). Использовали электрораспылительную ионизацию в режиме регистрации положительных ионов. В спектрах интенсивны сигналы протонированных молекул ДЭМФ (m/z 212), ДПМФ (m/z 240), ДЭАС (m/z 265) и ДПАС (m/z 321). При работе в режиме выбранных ионных реакций для большинства соединений не возникает необходимости полного хроматографического разделения компонентов смеси, поскольку набор выбранных ионных реакций для каждого соединения специфичен, и влияние сигнала от посторонних компонентов на аналитический сигнал аналита в этом случае ничтожно мало. В качестве неподвижной фазы использовали колонку с обращенно-фазовым сорбентом Zorbax SB-C18 длиной 150 мм, внутренним диаметром 4.6 мм, размером зерна сорбента 1.8 мкм, фирмы Agilent.

Изучаемые маркеры обладают кислотными свойствами, поэтому в ходе их хроматографического разделения использовали подвижную фазу, состоящую из аценонитрила и 0,5%-го раствора муравьиной кислоты в воде. В выбранных условиях градиентного элюирования коэффициенты ёмкости (k) ДЭМФ, ДПМФ, ДЭАС и ДПАС составили 3,9; 6,6; 3,6 и 6,6 соответственно; они приемлемы для хроматографического разделения.

В качестве критерия присутствия ДПМФ, ДЭМФ, ДЭАС и ДПАС в пробах использовали время удерживания и совпадение двух пар выбранных ионных переходов, соответствующих определяемому компоненту.

Разработанный способ опробован при анализе растворов смесей соединений-маркеров в реальных пробах воды. Проверку правильности подхода проводили методом «введено – найдено». В качестве объектов для исследования использовали образцы воды различного состава: водопроводную воду, колодезную воду, воду из скважины и речную воду. Определению ДПМФ, ДЭМФ, ДЭАС и ДПАС во всех исследуемых типах водных проб не мешало присутствие неорганических анионов, ионов металлов, повышенные значения жёсткости, мутности и цветности [6].

Определение метилфосфоновой кислоты. Разработан способ определения метилфосфоновой кислоты (МФК) в водных объектах, позволяющий быстро контролировать наличие МФК на уровне десятков нг/мл. В масс-спектре МФК присутствует интенсивный сигнал с m/z 95, соответствующий депротонированной молекуле МФК, а также два сигнала с m/z 113 и 141, соответствующие аддуктам депротонированной молекулы МФК с молекулой воды и муравьиной кислоты. В спектре ионов-продуктов преобладает сигнал с m/z 79, которому соответствует молекула, образующаяся в ячейке соударений при потере метильной группы. Для определения был выбран ионный переход с m/z 95→79, а для качественного подтверждения переход m/z 95→63.

В качестве подвижной фазой использовали раствор, состоящий из 0,5%-й муравьиной кислоты в воде и ацетонитрила в соотношении 95:5 по объёму. Наиболее подходящие значения, при которых наблюдается максимальная интенсивность сигнала ионов с m/z 95, 79 и 63, для потенциала на входе в масс-анализатор – 50 В, а для энергии соударений – 20 В для m/z 79 и 25 В для m/z 63. Изменение скорости потока газа-распылителя от 8 до 10 л/мин и температуры газа-распылителя от 200 до 350°С привело к десятикратному увеличению сигнала, соответствующего ионным переходам 95→79 и 95→63.

Правильность разработанного подхода определяли методом «введено – найдено» [7].

Был также разработан высокочувствительный способ определения МФК в виде производного с п-бромфенацил бромидом (ПБФБ), реагентом, переводящим МФК в менее полярное соединение с более высокой молекулярной массой. Реакцию дериватизации проводили по схеме на рис. 3.

Рис. 3. Реакция дериватизации МФК п-бромфенацил бромидом.

Для определения МФК в виде производного применяли гидрофильную хроматографию с тандемным масс-спектрометрическим детектированием. Хроматографическое разделение проводили на колонке Luna HILIC (150 мм × 4,6 мм, 5 мкм). Наилучшая форма хроматографического пика и чувствительность определения была достигнута при использовании в качестве подвижной фазы 10 мМ ацетата аммония и ацетонитрила. Разделение проводили в режиме градиентного элюирования при скорости потока 0,4 мл/мин. Время удерживания производного МФК при данной скорости потока составило – 6±0.5 мин. Масс-спектрометрическое детектирование проводили по выбранным ионным переходам. В масс-спектре производного присутствуют наиболее интенсивные сигналы ионов с соотношением m/z 293 и 291 один к одному, соответствующие депротонированным молекулам производного МФК.

Применение дериватизирующего реагента привело к снижению предела определения МФК в 5-10 раз по сравнению с определением МФК без дериватизации. Ограничением при определении МФК в виде производного является невозможность проведения реакции дериватизации в водной среде. При анализе образцов природных вод проводили упаривание водной матрицы и смену растворителя на ацетонитрил. Упаривание проводили при помощи отгонки при пониженном давлении на ротационном испарителе.

Правильность способа оценивали методом «введено – найдено». Показано, что матрица не оказывает мешающего влияния на ионизацию, выход реакции дериватизации и коэффициент концентрирования. С учётом коэффициента концентрирования предел обнаружения МФК в природных водах составил 100 пг/мл. Методика характеризуется высокой воспроизводимостью реакции дериватизации, высоким коэффициентом концентрирования МФК, высокой чувствительностью и приемлемым временем удерживания деривата [8].

Предложен способ определения МФК и О-алкилметилфосфонатов в грунтово-пылевой смеси. Было обнаружено, что при условиях дериватизации, описанных выше, О-алкилметилфосфонаты, в отличие от МФК, не подвергаются дериватизации. Это объясняется их более высокими значениями константы кислотности (pKa 3,3 против 2,12) и недостаточным высоким рН среды. Разница в поведении соединений позволила разработать высокочувствительный способ совместного определения МФК и О-алкилметилфосфонатов. Вещества разделяли на колонке Luna HILIC при скорости потока 1,5 мл/мин., в качестве подвижной фазы выступала смесь растворителей, состоящая из 10 мМ ацетата аммония в воде и ацетонитрила.

Для анализа образцов грунто-пылевой смеси необходимы её диспергирование, экстрагирование водой в УЗ-ванне в течение 20 минут, центрифугирование надосадочного слоя в течение 2 минут, фильтрование, упаривание водной матрицы до 50 мкл и растворение в ацетонитриле. Упаривание проводили методом отгонки при пониженном давлении на ротационном испарителе.

Оценивали степень извлечения МФК и О-алкилметилфосфонатов при экстрагировании водой, коэффициент концентрирования, матричный эффект, строили градуировочную зависимость в диапазоне концентраций для водных стандартных растворов МФК и О-аллилметилфосфонатов 0,005–100 нг/мл, оценивали предел обнаружения (ПО), прецизионность в течение одного дня и в разные дни.

Разработанный подход использовали для анализа реальных объектов, содержащих продукты деструкции химического оружия. Реальные образцы представляли собой пробы грунто-пылевой смеси с места бывшего завода по производству химического оружия в Волгоградской области [9].

---

Вы можете обсудить книгу, и возможно задать вопрос автору в
Facebook группе "Книги. Издательство. Репринт.".
Также в этой группе можно узнать о новостях Издательства книг PRESS-BOOK.RU.

Наши книги  |  Наши авторы